Penulis:
Lula Kamilia Az-Zahra. Rini Fauziah, Shayla Sonda Stoodley
JurnalPost.com – Di era diagnostik modern, identifikasi materi genetik menjadi salah satu pendekatan penting dalam mendeteksi keberadaan mikroorganisme maupun menganalisis karakteristik genetik suatu organisme. Salah satu teknologi yang menjadi dasar berbagai metode deteksi molekuler adalah Polymerase Chain Reaction (PCR), yaitu teknik yang digunakan untuk memperbanyak fragmen DNA sehingga dapat dianalisis dengan lebih mudah. PCR bekerja dengan memperbanyak DNA melalui tiga tahap yang dilakukan berulang sebanyak 30–40 siklus. Tahap pertama adalah denaturasi pada suhu 94–98°C, di mana dua untai DNA dipisahkan menjadi rantai tunggal. Tahap kedua adalah annealing pada suhu 50–65°C, yaitu saat primer menempel pada bagian spesifik DNA target sebagai titik awal penyalinan. Selanjutnya, pada tahap ekstensi dengan suhu sekitar 72°C, enzim Taq polimerase membentuk untai DNA baru berdasarkan cetakan DNA target. Pengulangan ketiga tahap ini menyebabkan jumlah DNA meningkat secara eksponensial hingga menghasilkan jutaan salinan DNA dalam waktu singkat.
Sebelum membahas lebih lanjut mengenai PCR, terdapat beberapa istilah penting yang perlu dipahami. Amplifikasi adalah proses penggandaan DNA target hingga jumlahnya cukup untuk dideteksi. Primer berfungsi sebagai titik awal pembentukan DNA baru, sedangkan probe digunakan untuk mengenali urutan DNA target dan menghasilkan sinyal fluoresensi. Nilai Ct (Cycle Threshold) menunjukkan siklus saat sinyal pertama kali terdeteksi, di mana nilai yang lebih rendah menandakan jumlah DNA target awal yang lebih tinggi. Pada PCR konvensional, hasil amplifikasi DNA umumnya divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel, yaitu metode pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukurannya.
Pada awal perkembangannya, PCR digunakan dalam format singleplex PCR, yaitu metode yang hanya mampu mendeteksi satu target DNA dalam satu kali reaksi. Teknik ini memanfaatkan satu pasang primer yang dirancang khusus untuk mengenali urutan DNA tertentu. Karena hanya berfokus pada satu target, singleplex PCR memiliki spesifisitas yang tinggi dan relatif mudah dioptimasi. Namun, ketika beberapa target perlu dianalisis secara bersamaan, metode ini menjadi kurang efisien karena setiap target harus diperiksa dalam reaksi yang terpisah.
Untuk meningkatkan efisiensi analisis, dikembangkan multiplex PCR, yaitu metode yang memungkinkan amplifikasi beberapa target DNA dalam satu tabung reaksi menggunakan lebih dari satu pasang primer. Dengan pendekatan ini, beberapa target dapat dideteksi secara simultan sehingga penggunaan sampel, waktu, dan reagen menjadi lebih hemat dibandingkan singleplex PCR. Meskipun demikian, penerapan multiplex PCR memerlukan optimasi yang lebih kompleks karena banyaknya primer yang digunakan dapat menyebabkan kompetisi selama proses amplifikasi. Oleh karena itu, desain primer dan kondisi reaksi yang tepat menjadi faktor penting dalam keberhasilan metode ini.
PCR konvensional ibarat memasak dengan panci tertutup, hasilnya baru ketahuan setelah selesai, lewat proses gel elektroforesis yang panjang. Real-Time PCR hadir untuk mengubah itu: prosesnya bisa dipantau langsung, siklus per siklus, di layar komputer. Kuncinya ada pada TaqMan Probe, rantai DNA pendek yang menempel spesifik pada target, dengan fluorofor di ujung 5’ dan quencher di ujung 3’. Selama probe utuh, quencher memadamkan cahaya fluorofor (prinsip FRET). Baru ketika enzim Taq polimerase memotong probe saat tahap ekstensi, fluorofor terlepas dan memancarkan sinyal cahaya, tanda bahwa target DNA berhasil diamplifikasi.
Sinyal ini muncul di setiap siklus secara real-time, tanpa perlu membuka tabung atau menjalankan elektroforesis. Hasilnya pun lebih kaya: bukan sekadar “ada atau tidak,” tapi berapa banyak, lewat nilai Ct (Cycle Threshold) yang semakin rendah jika DNA target makin banyak. Dibanding PCR konvensional, Real-Time PCR singleplex unggul dalam tiga hal: sensitivitas yang jauh lebih tinggi, spesifisitas yang lebih ketat berkat probe yang sangat selektif, dan kemampuan kuantifikasi yang membuka era baru diagnostik molekuler, sebelum akhirnya dikembangkan lebih jauh menjadi sistem multiplex.
Setelah berkembangnya Real-Time PCR singleplex dengan TaqMan Probe yang mampu mendeteksi satu target secara spesifik dan memantau proses amplifikasi secara langsung, para peneliti mulai mengembangkan metode yang lebih efisien untuk menganalisis beberapa target sekaligus. Kebutuhan ini muncul karena dalam banyak kasus, terutama pada diagnosis penyakit dan penelitian molekuler, diperlukan pemeriksaan lebih dari satu gen atau patogen dalam waktu yang bersamaan. Dari sinilah lahir Real-Time PCR Multiplex TaqMan Probe, yaitu teknologi yang menggabungkan keunggulan Real-Time PCR dengan kemampuan multiplex untuk mendeteksi beberapa target dalam satu reaksi.
Pada metode ini, setiap target memiliki primer dan probe spesifik yang diberi label fluorofor berbeda. Saat proses amplifikasi berlangsung, probe akan menempel pada target DNA yang sesuai dan menghasilkan sinyal fluoresensi ketika dipotong oleh enzim DNA polimerase. Karena setiap probe memancarkan warna fluoresensi yang berbeda, instrumen Real-Time PCR dapat membedakan dan mendeteksi beberapa target secara simultan dalam satu tabung reaksi. Dengan demikian, berbagai target genetik dapat dianalisis secara bersamaan tanpa perlu melakukan reaksi PCR secara terpisah untuk setiap target.
Keunggulan utama Real-Time PCR Multiplex TaqMan Probe terletak pada efisiensinya. Teknologi ini mampu menghemat waktu, biaya, dan penggunaan sampel karena beberapa target dapat diperiksa dalam satu kali analisis. Kemampuan tersebut menjadikannya banyak digunakan dalam bidang kesehatan untuk mendeteksi berbagai patogen penyebab penyakit secara bersamaan, dalam keamanan pangan untuk mengidentifikasi kontaminan mikroba, serta dalam penelitian molekuler untuk menganalisis ekspresi gen dan variasi genetik. Dengan hasil yang cepat dan akurat, metode ini menjadi salah satu alat penting dalam laboratorium modern.
Meskipun menawarkan banyak keuntungan, penerapan Multiplex TaqMan Probe masih menghadapi sejumlah tantangan, seperti desain primer dan probe yang harus sangat spesifik serta potensi kompetisi antar target selama proses amplifikasi. Selain itu, jumlah target yang dapat dideteksi juga bergantung pada kemampuan instrumen dalam membedakan berbagai sinyal fluoresensi. Namun, perkembangan teknologi terus dilakukan untuk meningkatkan sensitivitas, akurasi, dan kapasitas deteksi metode ini. Oleh karena itu, Real-Time PCR Multiplex TaqMan Probe dipandang sebagai salah satu teknologi yang memiliki prospek besar dalam mendukung kemajuan diagnostik, keamanan pangan, pemantauan lingkungan, dan penelitian biologi molekuler di masa depan.
DAFTAR PUSTAKA
Li, Zixi. (2025). The Principle, Application and Development Prospect of the Technology PCR. Theoretical and Natural Science. 112. 35-41. 10.54254/2753-8818/2025.AU23543.
Wainman, L. M., Sathyanarayana, S. H., & Lefferts, J. A. (2024). Applications of digital polymerase chain reaction (dPCR) in molecular and clinical testing. The Journal of Applied Laboratory Medicine, 9(1), 124–137. https://doi.org/10.1093/jalm/jfad103
Kopylova, K. V., Kasparov, E. W., Marchenko, I. V., & Smolnikova, M. V. (2023). Digital PCR as a Highly Sensitive Diagnostic Tool: a Review. Molecular Biology, 57(5), 771-781. doi: 10.31857/S0026898423050051
Malau, J., Zahro, A. F. ., Zahra, A. A. ., Kasasiah, A. ., Meilani, N. D., Damara, D. S., Lestari, A. N. ., Saryono, & Wahyono, D. J. . (2025). Advancements in Real-Time PCR Technologies: A Comprehensive Review of Probe-Based and Non-Probe-Based Assays for Molecular Diagnostics. Science and Technology Indonesia, 10(3), 660–677. https://doi.org/10.26554/sti.2025.10.3.660-677